临床诊断中的实时PCR 技术

　目前,DNA 分析技术已被广泛应用于临床,包括分子遗
传学、肿瘤学、微生物学、血液学及免疫学,其中许多技术依
赖于靶分子的PCR 扩增及扩增后分析,如限制性酶切与凝
胶电泳以检测特异性扩增片段。这种定性检测重复性差,可
靠性低,易给临床诊断带来混乱,而实时PCR 的出现实现了
DNA 的定量分析,明显提高了诊断的特异性、灵敏度,快速、
简单、自动、有效。有多种反应平台可以完成实时PCR 分
析,如Roche Light Cycler 、ABI Prism7700、PE5700 和超速热
循环仪等。
1 　实时PCR的生化特征
目前,许多实时PCR 技术都基于同样的原理:即每产生
一分子靶DNA 即产生一个信号分子的改变,当足量的靶基
因通过检测系统时就会产生信号的积累从而被检测。检测
扩增过程的技术包括非特异性双链DNA 染色和特异性探针
杂交系统。
111 　非特异性检测　染料(如SYBR Green Ⅰ) 结合到双链
DNA 上时能够产生很强的荧光信号。在PCR 过程中,当染
料结合到合成的DNA 分子上时,产生的递增信号就会被实
时检测。当扩增反应完成时,通过缓慢加温双链DNA 解链,
结合其上的染料脱落导致信号下降从而被检测1 。由于反
应中每类DNA 都有其特征性融链过程,从而可以提高检测
结果的可靠性。但其主要缺点在于染料非特异地结合双链
DNA ,并不能区分引物二聚体及非特异性扩增产物,故应优
化检测条件以降低扩增产物的非特异性。
112 　特异性探针杂交系统　许多探针检测系统依赖于信号
产生过程中荧光素介导的能量传递( FRET) , FRET 包括能
量从一个供体分子受体分子的非递减性能量传递,能量传递
的效率与Dx106 成比例,D 是供受体分子之间的距离。其它
探针系统,如Taqman 探针、分子信标与ScorpionTM引物等,
则依赖探针在游离状态下报告荧光基团与淬灭分子的接近
使其荧光淬灭。当探针杂交到靶分子上时,由于杂交时的构
型变化或Taq 聚合酶的5’核酸外切酶活性,报告基团的荧光
素游离出来产生信号的增加。
Taqman 探针系统包括一个探针序列,其两端各标记一
个荧光素分子及淬灭分子。在PCR 过程中,当探针杂交到
靶序列上时,Taq 聚合酶5’→3’外切酶活性剪去探针,继而
荧光素与淬灭分子分离产生荧光信号的增加。
分子信标与Scorpion 引物都包含一个发夹结构的探针序列
(探针5’和3’互补) ,探针在游离状态下其5’的荧光素分子和3’
的淬灭分子很接近。当杂交到靶序列上时,茎环结构张开,荧光
素与淬灭分子分离产生信号的增强,研究表明,分子信标由于具
有茎环结构而比Taqman 探针具有更高的特异性2 。
2 　实时PCR的临床应用
211 　基因型检测　FRET 探针被用来检测α- 抗胰蛋白酶抗体等位基因Pi
3
Z 与Pi
3
S3 ,50 多个个体被鉴定且所有基
因型与PCR 限制性片段长度多态性分析所得的结果相一
致。同样的方法用来分析凝血酶原突变与人类血小板抗原
基因等4 ,5 。Taqman 探针检测系统是目前所有实时PCR 中
最成熟的技术,它在基因变异检测方面的应用已有广泛报
道,较近的如检测凝血酶原及亚甲四氢叶酸酯(MTHFR) 基
因突变6 。Taqman 探针结合等位基因特异性引物可用来检
测药物代谢酶类的多态性与HLA - DRB 等位基因7 。借助
于ABI 7700 ,分子信标已被用来检测MTHFR 基因中C677T
突变,Scorpion 引物被用做检测五个常见的囊纤维化基因突
变子8 。运用PE5700 软件,SYBR Green Ⅰ与PCR 产物的
结合能够定量线粒体DNA(mtDNA) 9 。
212 　病原菌检测　FRET 探针与Light Cycler 被用于水痘
—带状疹疱和疱疹单一病毒粒子检测10 ,其灵敏度高于培
养分析法。Taqman 探针系统被用于流感病毒的分型及脑膜
炎双球菌DNA 的检测,其灵敏度与特异性均高于培养分析
法11 。利用Taqman 探针系统与ABI 7700 检测慢性HBV
感染病人中HBV 粒子,其分析范围可达每ml 标本373 -
1010基因组拷贝,且室间与室内Ct 的CV 值分别为1165 %和
1185 %12 。在HBV 的研究中, Taqman 法被认为是具有高
度重复性与灵敏度的,标本中只要每ml 含有10 - 109 病毒
拷贝就可被精确检测13 。
213 　定量mRNA　传统方法的灵敏度均达不到检测低表达
mRNA 的要求,因一些编码受体和内部信息分子的mRNA
拷贝数极低,只能用定量逆转录(QRT) PCR 方法,通过在不
同反应管中加入内标,控制RT - PCR 的扩增效率才能精确
测定mRNA 水平14 。早在1988 年Rappolce 等人就将此法
用于TGF -αmRNA 表达水平分析。
214 　肿瘤研究　Cairns 等15 在考察原发性膀胱癌中,用定
量PCR 检测P16 (DPS1752) 的拷贝数,可测出80 %原发膀胱
癌,而用微卫星法检测同一序列只能检出50 % ,且其检测速
度慢于前者。利用ABI 7700 与Taqman 探针检测非霍杰金
淋巴瘤,实时PCR 与常规PCR 比较,相关性为9818 % ,但实
时PCR 能够检出常规PCR 检测不出的易位16 。Light Cy2
cler 与Taqman 探针被用于小儿急性淋巴细胞白血病微量残
留病变的定量17 。Barbany 等利用Taqman 探针检测到慢粒
病人中bcr/ ab1 转录子,检出率达十万分之一18 。
3 　实时PCR的可靠性
灵敏度、特异性和精确度是评价基因定量分析方法可靠
性的重要指标。从临床工作的需要来看,针对不同病人和疾
病的不同阶段,对检测技术参数的要求有所侧重。
311 　特异性　识别点突变的能力是许多分析方法的重要特
征。分子信标由于具有茎环结构,可使探针与错配碱基之间
的杂交不稳定,从而被认为比Taqman 探针更具特异性。利用Taqman 探针与分子信标来研究人雌激素受体基因的3 个
单核苷酸多态性(SNPs) 表明,其中两个结果一致,然而分子
信标却提供了富含GC 靶序列区更为可靠的基因型19 。此
外,探针的长度、荧光素结合的温度、聚合酶、盐离子浓度及
退火温度的最佳选择都有助于提高实时PCR 检测的特异
性,减少非特异性扩增。
312 　灵敏度　在许多情况下,理想的检测限度是达到单分
子水平。标本中竞争子和抑制子的出现、体系中本底荧光的
干扰都会影响检测的灵敏度。本底荧光的干扰主要来自没
有完全淬灭的探针、标本中的非特异性信号及特异的污染物
或竞争子。借助于Light Cycler 体系及杂交探针,能够特异
性检测3pg 人类基因组DNA 中单拷贝的β球蛋白基因,对
其他靶序列的研究也有同样的报道20 。研究表明,分子信
标与Scorpion 由于具有二级结构其荧光分子能在游离状态
下有效的淬灭, Taqman 探针由于没有此结构而具有较高的
本底荧光,降低了分析的灵敏度。
313 　重复性　当DNA 起始模板数很低时,由于模板扩增过
程中出现的碱基错配使变异系数增大。最近研究表明,在利
用Light Cycler 分析模板数对测定方法CV 值影响时发现重
复15 次,起始模板拷贝数为105 时CV 值为519 % ,103 时
CV 值为818 % ,10 拷贝为41 %21 。对临床标本而言,重复
性是很关键的,尤其是在检测低拷贝数的靶序列时。标准的
操作规程、生化试剂及标准品的使用有助于减少室内变异系
数,提高检测的重复性。
4 　存在的问题
当今DNA 分析技术的迅猛发展实现了DNA 靶序列的
实时定量检测,它不仅缩短了检测时间,减少了污染的发生,
而且提高了分析数据的可靠性,已被广泛应用于肿瘤学、遗
传学及感染性疾病的基础研究与临床诊断。但在临床应用
中,对检测数据的阐释将受到多种因素的影响。不断更新的
生化试剂在特异性和灵敏度方面的差异、不同平台间反应动
力学的区别及实验对照与临界值的选择。因而各实验室应
明确检测的临界值、设立正确的实验对照、规范标准操作与
生化试剂以有助于室间比较。随着实时PCR 操作过程中各
种条件的不断优化与完善,相信在未来的时间里,实时PCR
必将在临床诊断中发挥更大的作用。
参考文献
1 Ririe K, Rasmussen R , Wittwer C. Product differentiation b y analy2
sis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal
Biochem. 1997 , 245 :154.
2 T yagi S , Kramer F. Molecular Beacons : probes that fluoresce upon
hybridization. Nat Biotechnol. 1996 , 14 :303.
3 Aslanidis C , Nauck M , Schmitz G. Hi gh - speed detection of the
two common a - antitrypsin deficiency alleles Pi
3
Z and Pi
3
S by real -
time fluorescence PCR and melting curves. Clin Chem. 1999 , 45 :1872.
4 Aslanidis C , Schmitz G. Hi gh - speed apolipoprotein E genotyping
and apolipoprotein B3500 mutation detection using real - time fluores2
cence PCR and melting curves. Clin Chem. 1999 , 45 :1094.
5 Aslanidis C , Nauck M , Schmitz G. Hi gh - speed prothrombin G→